近日，我校农学院陈彦惠、李成伟、郑旭团队在《Plant Biotechnology Journal》上联合发表了题为“The ZmFKF1b-ZmDi19-5 Regulatory Module CoordinatesDrought Tolerance and Flowering Time in Maize”的研究论文。该研究首次揭示了玉米中的干旱诱导蛋白ZmDi19-5具有调控干旱耐受性与开花时间的双重功能，且该蛋白可与ZmFKF1b蛋白互作并形成复合体，通过调控下游干旱靶基因ZmHsf08和开花靶基因ZmCOL3的表达，精准实现玉米干旱耐受能力与开花时间的动态平衡。
以玉米B104为实验背景，研究团队利用CRISPR/Cas9技术构建zmdi19-5敲除突变体，同时构建了ZmDi19-5过表达株系，以此探究该基因对玉米干旱耐受性的影响。苗期干旱胁迫试验表明，ZmDi19-5过表达株系在干旱条件下的存活率显著优于野生型，其叶片相对含水量也维持在更高水平；而zmdi19-5敲除突变体则表现出明显的干旱敏感表型，存活率与相对含水量均较野生型大幅降低。后续针对各株系的脯氨酸积累量、抗氧化酶活性等干旱相关生理生化指标的测定结果，进一步佐证了ZmDi19-5对玉米干旱耐受性的正向调控作用。
图1.ZmDi19-5增强玉米对干旱胁迫的耐受性
为挖掘ZmDi19-5的互作调控网络，研究者通过对ZmDi19-5进行酵母双杂交（Y2H）筛选发现，ZmDi19-5可以与蓝光受体蛋白ZmFKF1b发生互作作用，通过构建ZmFKF1b不同结构域的截短载体进行互作验证，明确二者的互作依赖于ZmFKF1b的F-box结构域。亚细胞定位结果显示，ZmDi19-5蛋白定位于细胞核内，这为二者在特定亚细胞区域发生互作提供了空间依据；进一步利用双分子荧光互补（BiFC）实验，在烟草叶片的细胞核中观察到荧光互补信号；最终，免疫共沉淀（Co-IP）实验通过特异性抗体捕获复合体，从体内水平再次确认了二者的互作关系，形成了完整的互作验证证据链。
图2. ZmDi19-5与ZmFKF1b相互作用
为了探究ZmDi19-5与ZmFKF1b是否参与调控玉米开花，研究者分别在长日照条件下以及短日照条件下记录转基因株系的开花时间。结果发现，无论是在长日照条件还是短日照条件，ZmDi19-5过表达株系均表现为开花延迟，而zmdi19-5突变体则提前开花。与此相反，ZmFKF1b过表达株系在长日照条件下和短日照调间隙均提前开花，而zmfkf1b突变体则开花延迟，且干旱胁迫会进一步加速所有基因型开花。
图3. ZmDi19-5和ZmFKF1b转基因株系的开花时间表型
作为转录因子，ZmDi19-5可通过转录调控机制影响下游靶基因的表达。为精准筛选受其直接调控的候选基因，研究人员首先整合RNA测序（RNA-seq）与DNA亲和纯化测序（DAP-seq）数据集，结合功能注释分析，初步鉴定出一批与植物信号转导、非生物胁迫响应及氧化还原过程相关的潜在靶基因。为验证这些靶基因与ZmDi19-5的调控关系，研究团队进一步采用多层级实验手段：通过实时定量PCR（RT-qPCR）分析各靶基因在ZmDi19-5转基因株系中的表达变化，缩小核心靶基因范围；借助酵母单杂交（Y1H）实验验证ZmDi19-5与靶基因启动子的结合能力；利用凝胶迁移实验（EMSAs）从体外层面证实二者的直接物理结合；最终通过双荧光素酶（Dual-Luc）实验明确调控效应。结果显示，ZmDi19-5可特异性结合干旱胁迫响应基因ZmHsf08的启动子区域，并对其表达发挥负向调控作用；且进一步研究发现，该调控过程会受到ZmFKF1b的影响，即ZmFKF1b可改变ZmDi19-5对ZmHsf08的抑制效应。
图4. ZmDi19-5直接抑制ZmHsf08的转录
与此同时，研究人员还发现玉米开花抑制因子ZmCOL3是ZmDi19-5的潜在互作靶标。为明确二者的调控关系，研究团队通过酵母单杂交实验首先验证：ZmDi19-5可特异性结ZmCOL3的启动子区域；随后凝胶迁移实验进一步从体外层面证实，ZmDi19-5可精准识别ZmCOL3启动子中的关键顺式作用元件。功能层面研究显示，ZmDi19-5通过结合ZmCOL3启动子，显著促进ZmCOL3的转录表达；而ZmCOL3作为开花抑制因子，其表达量升高会进一步抑制成花素基因ZCN8的表达，最终实现对玉米开花时间的调控。此外，研究还发现ZmFKF1b可参与这一调控过程：ZmFKF1b通过与ZmDi19-5的蛋白互作，能够显著减弱ZmDi19-5对ZmCOL3的转录促进效应，进而间接影响玉米开花进程。
图5. ZmDi19-5直接转录促进ZmCOL3的表达
陈彦惠教授、李成伟教授和郑旭教授为本论文的共同通讯作者，博士生曾海霞为论文第一作者，河南省农业科学院农作物种质资源研究所豆丹丹博士为论文的共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金和河南省农业（玉米）良种联合攻关项目的资助。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70404
