本网讯（通讯员 焦健）近日，我校园艺学院苹果科技创新团队在园艺作物重要病原微生物快速检测方面取得重要进展。该研究开发了一个新型CRISPR/LbCas12a突变体蛋白，比现有商品化LbCas12a蛋白具有更强的活性和更广泛的PAM序列适应性。借助此突变体蛋白并整合一套生物信息学分析流程，能够方便快捷的设计病原微生物的检测靶标位点，实现对检疫性病原物（苹果火疫病、西瓜细菌果斑病病原菌等）的田间可视化快速检测。
LbCas12a在分子诊断方面有很大的应用前景，通过识别特定的dsDNA序列对ssDNA进行非特异性切割，特别适合于检测病毒和病原菌。虽然现有的基于Cas12a的核酸检测已经成为一种灵敏（aM级）特异的诊断方法，但仍需进一步完善。所需改进之一就是LbCas12a蛋白更倾向于识别基因组中频率较低的5’-TTTV-3’ PAM（V表示A/G/C），这会阻碍crRNA靶标位点的设计，使得靶标位点选择过少。
图1新型LbCas12a突变体蛋白的突变位点以及活性分析
该研究将5个突变（D156R、G532R、K538V、Y542R和K595R）同时导入LbCas12a蛋白从而产生相应的LbCas12a变体，称为LbCas12a-5M（图1A-B）。荧光检测显示，这些氨基酸突变可以在一定程度上显著提高其对 TTTV PAM靶标的活性，并识别非常规TNTN PAM，保留更强大的反式切割活性；通过Michaelis-Menten动力学分析，LbCas12a-5M的催化效率（以Kcat/Km值表示）是LbCas12a-wt的1.2倍和2.5倍，表明LbCas12a-5M突变体比野生型蛋白活性更强，PAM适应性更广，更适合应用于核酸检测。
图2 特异性检测位点设计与灵敏度分析
借助宏基因组分析软件Metaphlan v 3.0，整合并开发了一套针对于细菌微生物的crRNA靶标设计流程。结合LbCas12a-5M可视化检测系统，可以不借助试验仪器，在田间30min之内，快速可视化检测苹果火疫病病原菌E. amylovora和西瓜细菌果斑病病原菌A. citrulli，灵敏度可以与qPCR媲美。该研究工作有助于更好地理解如何构思、建立和应用基于CRISPR/Cas12a系统的、稳定快速的诊断方法以用于病原菌检疫，适用于包括植物、动物、人类致病细菌以及土壤和环境中存在的有益或有害细菌在内的任何何细菌微生物的检测，这将有助于阻止细菌性疾病的传播和爆发。
该研究以题为“A sensitive visual method for onsite detection of quarantine pathogenic bacteria from horticultural crops using an LbCas12a variant system”的论文形式在线发表于生态环境领域国际著名期刊Journal of Hazardous Materials（中科院一区Top），这是继苹果病毒病田间可视化检测研究（Plant biotechnology journal；Jiao et al, 2021，中科院一区Top）后的又一成果。我校青年英才焦健博士为该论文第一作者，冯建灿教授和郑先波教授为共同通讯作者，河南农业大学为第一单位及第一通讯作者单位，中国农业科学院郑州果树研究所刘崇怀研究员为合作作者参与了本项研究工作。该研究工作得到了国家自然基金（31801818）、河南省科技攻关项目（212102110113）和河南农业大学青年英才项目（30500631）以及河南省重大公益科技专项（No. 201300110500）的资助。
论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2021.128038
编辑/孙慧敏 签审/毛会坡 审核/谢东明
