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本网讯（通讯员 郑先波 焦健）近日，我校苹果科技创新团队在植物学权威期刊《植物生物技术杂志》（Plant Biotechnology Journal）在线发表了题为《基于CRISPR/Cas12a技术的苹果病毒/类病毒田间可视化检测》（Field detection of multiple RNA viruses/viroids in apple using a CRISPR/Cas12a-based visual assay）的研究论文。该研究采用CRISPR/Cas12a核苷酸检测技术，同时整合了一套果树叶片RNA病毒快速提取以及可视化检测流程，首次对苹果的5种主要病毒实现田间、快速、可视化检测。该技术方法不依赖复杂的仪器设备，灵敏度和特异性强，可为其他农作物RNA病毒的快速检测提供重要技术支撑。《植物生物技术杂志》《Plant Biotechnology Journal》为中科院生物科学和植物科学领域1区杂志，在农艺与作物学科中排名第一。
苹果（Malus × domestica Borkh.）作为一种重要的经济水果，在全世界广泛种植。中国苹果种植面积和产量都稳居世界第一，但是大多数苹果园正遭受严重的病毒病危害。果树病毒病多为复合感染，并且无法通过有效的药剂治愈，只能通过脱毒苗木推广，并及时检测进行防控。目前果树病毒检测方法主要通过RT-PCR或RT-qPCR技术，耗时较长，操作繁琐，需要复杂昂贵的仪器，同时操作人员也需要专业培训。现有的诊断性检测方法极大地限制了实验室以外的应用，因此在果树种植和苗木生产中迫切需要一种适合田间快速简易的病毒检测方法。
基于RT-RPACas12aAuNPs检测技术的苹果病毒类病毒RNA 的检测示意图
该研究开发的RT-RPA/Cas12a/AuNPs检测平台，首先通过多重RT-RPA扩增技术，在常温下以苹果叶片总RNA粗提液为底物，同时扩增苹果ApNMV，ASPV，ASGV，ACLSV和ASSVd五种病毒/类病毒的特异性序列（步骤一）。随后上述扩增产物加入到病毒特异性Cas12a/crRNA系统中，病毒靶标序列将激活Cas12a蛋白的ssDNase乱切活性，从而降解非特异性的linker-ssDNA寡核苷酸序列（步骤二），此linker-ssDNA序列两端设计为可与纳米金颗粒交联的DNA序列（DNA1/2-AuNPs）互补配对。后续将Cas12a/crRNA系统与DNA1/2-AuNPs等体积混合，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色（阳性）。相反，当体系中没有病毒靶标序列时，Cas12a蛋白的ssDNase乱切活性无法被激活，完整的linker-ssDNA可使DNA1/2-AuNPs沉淀聚集，从而褪去红色（阴性）。
不同检测方法的灵敏度比较
该方法灵敏度高，可以检测到反应体系中低于25个病毒粒子（图2A），是普通RT-PCR的100倍(图2B)。其灵敏度可与RT-qPCR媲美（图2C），但是步骤更加简单，流程耗时短，在田间仅需1个小时即可知道结果。它为目前使用的基于实验室的诊断技术提供了一种有效的替代手段，以帮助快速确认感染病毒的苹果植株或筛选无病毒的苗木。
我校青年教师焦健博士为该研究第一作者，硕士研究生孔康康和韩金蒙参与了主要工作，冯建灿教授和郑先波教授为该研究共同通讯作者，河南农业大学为第一单位及第一通讯作者单位，中国农业科学院郑州果树研究所阎振立研究员以及团队成员张恒涛和张瑞萍为合作作者参与了本项研究工作。该研究工作得到了河南省高校重点科研项目（20A210025）、河南省高校科技创新团队项目（19IRTSTHINO09）和河南省现代农业产业体系大宗水果产业技术创新团队项目（S2014-11-G02, Z2018-11-03）的资助。近年来，我校狠抓科研团队建设，立足河南优势特色园艺作物成立创新团队。苹果科技创新团队围绕苹果产业中存在的瓶颈问题，瞄准科研前沿，积极立项开展研究并取得可喜成绩。
原文链接：onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/pbi.13474
编辑：王燕萍 孙慧敏
